Perkembangan
teknologi DNA rekombinan pada 1970-an menandai awal dari era baru untuk
biologi. Untuk pertama kalinya, ahli biologi molekuler dapat melakukan
manipulasi molekul DNA, sehingga memungkinkan untuk mempelajari gen dan
memanfaatkannya untuk mengembangkan obat baru dan bioteknologi (Hsu et al.
2015).
Semua
organisme selular telah mengembangkan strategi untuk melawan introduksi genom asing
khususnya parasit. Pada bakteri dan kebanyakan archaea, CRISPR (C lustered R egularly I nterspaced S hort P alindromic R
epeats) -Cas (C RISPR- protein sociated) baru-baru ini muncul sebagai
mekanisme adaptif pertahanan RNA-dimediasi yang memberikan resistensi yang
diperoleh/adatif untuk menyerang unsur genetik asing seperti bakteriofag dan
plasmid (Barrangou & Marraffini 2014). sistem pertahanan ini terdiri dari
protein Cas, dan satu atau lebih CRISPR yang mempunyai kumpulan urutan spacer-berulang pendek RNA CRISPR
(crRNAs) untuk menarget genom asing. Sistem CRISPR-Cas dapat digolongkan
menjadi 3 tipe utama, yaitu tipe I, II, dan III, dengan beberapa sub-tipe yang
dibedakan berdasarkan pemrosesan dan detail mekanisme interferensi (Makarova et al. 2011). Telah diketahui bahwa pada
sistem tipe I,II, dan III-A berkerja untuk menarget DNA, dan untuk sistem tipe
III-B bekerja untuk menarget RNA (Hale et
al. 2012).
Salah satu
sistem CRISPR-Cas yang popular dikalangan peneliti yaitu CRISPR-Cas9.
CRISPR-Cas9 merupakan sistem CRISPR-Cas yang berasosiasi dengan endonuklease 9,
yang digunakan sebagai urutan guide RNA dupleks, tracrRNA:crRNA, untuk
membentuk pasangan dengan urutan DNA target. CRISPR-Cas9 dapat memotong pada
sisi spesifik untai ganda DNA target (Doudna et al.
2014). Sistem
CRISPR-Cas memerlukan 2 komponen agar dapat bekerja aktif, yaitu
crRNA;tracarRNA yang selanjutnya menjadi
guide DNA (gDNA) dan protein asosiasi nuklease Cas9 (Yamamoto 2015). Selain 2 komponen tersebut, juga diperlukan
Protospacer Adjecent Motif (PAM) yang
nantinya akan menginisiasi pembentukan R-loop
(Gambar 2). Walaupun spesifitas
penargetan DNA kebanyakan tergantung pada ururtan gRNA, namun Cas9 juga
membutuhkan basa-basa tertentu, yang dikenal sebagai Protospacer Adjacent Motif (PAM). Urutan PAM bervariasi antar
spesies, seperti Streptococcus pyogenes
Cas9 (SpCas9) yang membutuhkan 5’-NGG-3’, Streptococcus
thermophilus yang membutuhkan 5’-NNAGAAW-3.
Gambar 1. Gambar skematik pada situs pengenalan
DNA target dan pemotongan DNA menggunakan kompleks gRNA-Cas9. Pertama-tama
SpCas9 mencari urutan PAM (5’-NGG-3’) pada DNA terget. Kemudian, gRNA dan DNA
target akan berpasangan melalui PAM. Setelah hibridisasi 20 pb, DNA target akan
dipotong oleh nuklease Cas9, menghasilkan ujung tumpul pada 3-pb hilir situs
PAM.
Segmen pendek tertentu akan berinteraksi
dengan lokus CRISPR. Gen CRISPR akan ditranskripsikan sehingga akan dihasilkan
crRNA yang komplemen terhadap genom DNA target. Mekanisme rekognisi/pengenalan
bergantung pada urutan crRNA dan urutan yang konserv/lestari pada ujung 3’ DNA
target, yaitu PAM, dengan urutan 5’-NGG-3’. Sebuah trans-activating crRNA
(tracrRNA) akan berpasangan secara komplemen ke pre-crRNA membentuk dupleks.
RNA dupleks ini akan dipotong oleh Rnase III untuk memebentuk struktur guide
RNA (gRNA), yaitu gabungan crRNA-tracrRNA yang membawa endonuklease Cas9 untuk
memotong DNA target.
Gambar 2. Sistem CRISPR-Cas tipe II-A.
Pemotongan target DNA menggunakan dupleks tracrRNA:crRNA yang selanjutnya akan
menjadi guide RNA (gRNA)
Adapun
aplikasi CRISPR-Cas9, yaitu sebagai objek penelitian biologis untuk terus
dikembangkan, sebagai obat bagi manusia, dalam bidang bioteknologi khususnya
dalam hal rekayasa genetika, dalam bidang pertanian untuk menghasilkan tanaman
transgenik sesuai dengan sifat yang diinginkan, serta masih banyak
bentuk-bentuk aplikasi lainnya. Sampai
saat ini, CRISPR-Cas9 telah banyak dikembangkan, terutama dalam bidang
penelitian DNA, yaitu untuk delesi DNA, insersi DNA, penggantian DNA,
modifikasi DNA, melabeli DNA, modulasi transkripsi, menargetkan RNA, dan masih
banyak pengembangan lainnya (Doudna et al.
2014).
Gambar 3. Mekanisme kerja genom editing menggunakan CRISPR-Cas9 (Royal Society of Biology, 2018)
Referensi :
Barrangou, R. &
Marraffini, L.A., 2014. Review CRISPR-Cas Systems : Prokaryotes Upgrade to
Adaptive Immunity. Molecular Cell, 54(2), pp.234–244. Available at:
http://dx.doi.org/10.1016/j.molcel.2014.03.011.
Doudna, J.A. et al., 2014.
The new frontier of genome engineering with CRISPR-Cas9.
Hsu, P.D. et al., 2015. HHS
Public Access. , 157(6), pp.1262–1278.
Royal Society of Biology, 2018, https://www.rsb.org.uk/biologist/158-biologist/features/1441-focus-on-gene-editing.
Diakses pada tanggal 7 September 2018, pukul 9.30 WIB.
Yamamoto, T., 2015. Targeted
Genome Editing Using Site-Speci c Nucleases, Hiroshima: Springer.
created by : Ahmad Ardi
Tidak ada komentar:
Posting Komentar